技術(shù)簡介

Ribo-seq，又稱為Ribosome Profiling或者翻譯組測序，能夠?qū)εc核糖體結(jié)合并正在被翻譯的約30 nt的mRNA片段進行測序，詳細檢測體內(nèi)的翻譯狀態(tài)，Ribo-seq是連接轉(zhuǎn)錄組學與蛋白質(zhì)組學之間的橋梁。該技術(shù)可構(gòu)建癌細胞全基因組水平上蛋白翻譯圖譜，量化蛋白質(zhì)翻譯效率，為基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供支持。

2016年發(fā)表在Cell上的“Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression"文章，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中表達上調(diào)的特異性tRNA，這些tRNA通過增強富含同源密碼子的轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和翻譯來驅(qū)動癌細胞轉(zhuǎn)移。這篇文章主要通過三個關(guān)鍵證據(jù)支持研究者的觀點：

l  特異性tRNA（tRNA^Glu_UUC和tRNA^Arg_CCG）在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中表達上調(diào)。

l  tRNAs促進了富含其同源密碼子的轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和翻譯。

l  tRNA^Glu_UUC通過直接上調(diào)EXOSC2和增強GRIPAP1來驅(qū)動轉(zhuǎn)移。

在之前的研究中，科學家發(fā)現(xiàn)編碼序列中存在特異性密碼子偏好，影響了蛋白質(zhì)的表達水平。另一方面，在不同物種中，tRNA含量與蛋白質(zhì)合成時密碼子使用偏倚相關(guān)，并調(diào)節(jié)基因的表達。這些研究將細胞通路激活與tRNA含量聯(lián)系起來。這篇文章的研究目的是通過對比非致瘤細胞系和乳腺癌細胞系中tRNA豐度，揭示tRNA的調(diào)節(jié)效應(yīng)以及在腫瘤進程中發(fā)揮的作用。

研究者首先對不同細胞系（非致瘤上皮細胞系MCF10a，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MDA-231和CN34，以及相對應(yīng)的高轉(zhuǎn)移亞系MDA-LM2和CN-LM1a）的tRNA進行測序和定量，發(fā)現(xiàn)兩組低轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞為獲得更高的轉(zhuǎn)移能力而選擇相似的tRNA豐度調(diào)節(jié)模式，并證實了特異性tRNA（tRNA^Arg_CCG和tRNA^Glu_UUC）在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中表達上調(diào)，驗證了tRNAs表達上調(diào)后癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力增加（但與細胞增殖能力無關(guān)），進一步支持了tRNA水平調(diào)節(jié)可以特異性促進癌細胞轉(zhuǎn)移的觀點。

研究使用Ribo-seq技術(shù)分別對對照組（Control）、tRNA^Arg_CCG過表達組（tRNA^Arg-OE）和tRNA^Glu_UUC過表達組（tRNA^Glu-OE）細胞系進行分析（Ingolia et al., 2014），檢測活躍核糖體翻譯組的調(diào)控結(jié)果，用于評估tRNA上調(diào)對轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程的影響。通過這些數(shù)據(jù)，科學家觀察到了普遍存在的核糖體保護片段（RPFs，ribosome protected fragments）的周期性和長度（Figures 4A, 4B, S4B, and S4C）。在過表達細胞系中，一些基因的相對核糖體占有率較高，這些基因的編碼序列中富含與特異性tRNA配對的同源密碼子（Figures 4C and S4D）。根據(jù)上述結(jié)果，測量了約4000個蛋白質(zhì)的表達水平直接評估tRNA調(diào)節(jié)對蛋白質(zhì)表達的影響。在過表達細胞系中，與特異性tRNA同源的密碼子含量較高的轉(zhuǎn)錄本普遍穩(wěn)定。

Figure 4. Post-Transcriptional Consequences of tRNA^Glu_UUC and tRNA^Arg_CCG Upregulation

Figure S4. tRNA^Glu_UUC and tRNA^Arg_CCG Overexpression Alters Ribosomal Occupancy and Translational Landscapes, Related to Figure 4

該研究分析了全基因組數(shù)據(jù)并重點關(guān)注了tRNA^Glu_UUC過表達細胞系的核糖體譜數(shù)據(jù)，確定了當tRNA^Glu_UUC豐度更高時，EXOSC2和GRIPAP1是潛在靶點。這些基因在高轉(zhuǎn)移細胞中高表達，但轉(zhuǎn)錄水平上無顯著上調(diào)，表明這些基因上調(diào)主要是由轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

利用Ribo-seq技術(shù)分析核糖體保護片段（RPF），將tRNA偏好、核糖體占用和蛋白質(zhì)表達之間相關(guān)聯(lián)。為了量化tRNA含量的變化對活躍核糖體翻譯組和蛋白質(zhì)表達的影響，研究者定義了一個tRNA偏好評分參數(shù)，并對轉(zhuǎn)移不良親本細胞系（MDA-par和CN34-per）及其高轉(zhuǎn)移衍生系（MDA-LM2和CN34-LM1a）進行了分析。核糖體保護片段（RPF）被歸一化為每個細胞系的總RNA（TT），用于解釋基因表達的差異。親本與衍生系之間的RPF/TT比率在生物學重復中保持一致，顯著正相關(guān)（Figures 7A and S7A）。將每個基因的tRNA偏好評分與其各自矯正的核糖體足跡重疊后，發(fā)現(xiàn)具有較高tRNA偏好評分的轉(zhuǎn)錄本在那些受核糖體結(jié)合較多的轉(zhuǎn)錄本中強烈富集（Figure 7B）。研究者隨后將每個基因轉(zhuǎn)錄本豐度進行歸一化處理，證實了高轉(zhuǎn)移亞系中，tRNA偏好得分高的基因顯著富集（Figure 7C）。以上結(jié)果表明，差異tRNA表達為蛋白質(zhì)翻譯圖譜的改變提供重要信息。

Figure 7. tRNA Preference Scores Were Informative of Differential Ribosome Occupancy and Protein Expression

Figure S7. Differential Protein Expression and tRNA Preference Scores, Related to Figure 7

這項研究證實了tRNA豐度的改變可以調(diào)節(jié)細胞中蛋白的表達，并且癌細胞可以通過調(diào)節(jié)tRNA水平來調(diào)整癌癥進程中的多數(shù)啟動子的表達。雖然文章中這種tRNA分析方法是基于乳腺癌細胞系研究，但研究者認為在其他疾病、模型和物種中還有更廣闊的應(yīng)用前景。

小結(jié)

Ribo-seq技術(shù)檢測到核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本與tRNA表達顯著相關(guān)，將基因表達調(diào)控中的轉(zhuǎn)錄過程與翻譯過程關(guān)聯(lián)起來，可以通過檢測mRNA核糖體保護片段（RPF），識別翻譯過程中的tRNA調(diào)控事件。Ribo-seq技術(shù)可以與DAP-seq/ChIP-seq、RNA-seq、tRNA-seq和質(zhì)譜等技術(shù)一起，將基因表達的調(diào)控過程完整呈現(xiàn)出來。

引用文獻

Goodarzi H, Nguyen HCB, Zhang S, Dill BD, Molina H, Tavazoie SF. Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression. Cell. 2016. 165(6):1416-1427.