文章標(biāo)題：Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study

發(fā)表年限：2024年

期刊：Cardiovascular Diabetology

影響因子：8.5

研究背景

2 型糖尿病（T2DM）和冠狀動(dòng)脈疾?。–AD）是常見(jiàn)的共存臨床疾病，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率仍在增長(zhǎng)。最近，循環(huán)RNA（miRNA）已成為心臟代謝疾病中的新型分子參與者。本研究旨在確定特異性 miRNA 特征作為 T2DM 中 CAD 的候選生物標(biāo)志物，并描繪導(dǎo)致糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的潛在 miRNA 依賴性機(jī)制。

研究方法

共收集來(lái)自患有和不患有 CAD 的 T2DM 患者、CAD 患者和健康對(duì)照的 38 份血漿樣品，使用微陣列對(duì) 2,578 個(gè) miRNAs 進(jìn)行表達(dá)譜分析。為了研究差異表達(dá) （DE）-miRNA 靶基因的調(diào)控作用，利用多種生物信息學(xué)工具進(jìn)行了功能注釋和通路富集分析。然后，利用 Cytoscape 軟件中的 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行聚類分析和樞紐基因鑒定。在 94 名參與者的較大復(fù)制隊(duì)列中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) （RT-qPCR） 以驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)。采用受試者工作特征分析評(píng)價(jià) miRNAs 的診斷價(jià)值。采用多因素 logistic 回歸分析開(kāi)發(fā)基于 miRNA 的診斷模型。

本文中通過(guò)Cytoscape v3.10.0 軟件中的STRING數(shù)據(jù)庫(kù)插件（stringApp v2.0.1）進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，來(lái)確定已驗(yàn)證的差異miRNA在T2DM-CAD中的調(diào)控作用，綜合置信度得分大于0.4的相互作用被保留。然后使用Cytoscape v3.10.0軟件中的分子復(fù)合物檢測(cè)（MCODE v2.0.3）插件來(lái)于深入了解PPI網(wǎng)絡(luò)中可能緊密連接的基因模塊（簇、子網(wǎng)絡(luò)），并進(jìn)行富集分析（Figure 1）。通過(guò)Cytoscape v3.10.0 軟件中的 CytoHubba 插件過(guò)濾PPI網(wǎng)絡(luò)，找到關(guān)鍵中心基因（Figure 2）。

Figure 1：

Figure 2：

Cytoscape是一個(gè)開(kāi)源的軟件平臺(tái)，用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和生物途徑，適用于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，同時(shí)也具有很多實(shí)用性的插件。今天我們來(lái)一起用軟件和插件，按文章中的邏輯和操作步驟，來(lái)畫(huà)一個(gè)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。

Part 1  Cytoscape的下載與安裝

Cytoscape在windows平臺(tái)只有64位版本在Cytoscape獲取最新下載地址，請(qǐng)注意，Cytoscape安裝需要配套的Java運(yùn)行環(huán)境，所以需要先安裝Java，安裝好后再進(jìn)行Cytoscape的安裝，根據(jù)安裝提示進(jìn)行下一步即可。

安裝Java后，需要配置環(huán)境變量，在電腦開(kāi)始菜單搜索“編輯系統(tǒng)環(huán)境變量"（win 11），點(diǎn)擊環(huán)境變量：

新建系統(tǒng)變量，變量名輸入JAVA_HOME，變量值輸入Java安裝路徑，點(diǎn)擊確定保存：

編輯Path環(huán)境變量，新建一行輸入Java路徑，點(diǎn)擊確定保存即可完成環(huán)境變量配置。

開(kāi)始菜單輸入cmd，繼續(xù)輸入java -version查看是否安裝成功，Java版本：

這里我們安裝的Cytoscape版本是3.10.3，Java版本為17.0.13，安裝好后我們來(lái)了解一些基礎(chǔ)功能。

Part 2  窗口功能基礎(chǔ)介紹

打開(kāi)Cytoscape后，啟動(dòng)面板可以大致分為以下幾部分內(nèi)容：

1.菜單

●File：文件菜單。可以進(jìn)行文件的導(dǎo)入和輸出，常用選項(xiàng)有：

?  Import：導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)或表格。                              

?  Export：導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖片或表格，也可導(dǎo)出為網(wǎng)頁(yè)。

?  Open Session / Open Recent Session：可以打開(kāi) Cytoscape 文件或列出最近打開(kāi)的會(huì)話文件，以便快速訪問(wèn)。

?  New Network：創(chuàng)建新網(wǎng)絡(luò)，可以編輯空白網(wǎng)絡(luò)，也可以從一個(gè)現(xiàn)有網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建。

?  Save Session：保存會(huì)話文件。

●Edit：編輯菜單?？梢赃M(jìn)行撤銷重做等。撤消和重做功能適用于最近執(zhí)行的 10 個(gè)任務(wù)?？梢詫⒆⑨屜蚯?、向后以及將其推或拉到前景層和背景層，常用選項(xiàng)有：

?  Undo/Redo：將所有已刪除的節(jié)點(diǎn)和邊進(jìn)行恢復(fù)或重做。

?  Destroy Networks/Views：刪除網(wǎng)絡(luò)或刪除現(xiàn)有的視圖，再次create view后回到初始風(fēng)格狀態(tài)。

?  Remove Duplicated Edges：用于刪除重復(fù)的邊（具有相同的源節(jié)點(diǎn)和目標(biāo)節(jié)點(diǎn)），只保留一條邊。

?  Remove Self-Loops ：用于刪除具有相同的源和目標(biāo)節(jié)點(diǎn)的邊。

?  Remove Selected Nodes and Edges：用于刪除選定的節(jié)點(diǎn)和邊。

●View：視圖菜單?？梢燥@示或隱藏各個(gè)窗口，也可以進(jìn)行放大縮小或適配網(wǎng)絡(luò)視圖。

●Select：選擇菜單。可以選擇點(diǎn)或邊進(jìn)行展示和隱藏。

●Layout：布局菜單。可以手動(dòng)調(diào)整節(jié)點(diǎn)位置，也可以通過(guò)布局菜單中的預(yù)設(shè)布局算法進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖布局的調(diào)整，這些布局算法也可以將節(jié)點(diǎn)和邊的數(shù)據(jù)列考慮進(jìn)去。常規(guī)布局有：

?  Layout Tools：節(jié)點(diǎn)布局工具，可以幫助自動(dòng)化或微調(diào)布局。選擇個(gè)別節(jié)點(diǎn)或全部節(jié)點(diǎn)，可以對(duì)邊的長(zhǎng)度、方向進(jìn)行調(diào)整，也可以設(shè)置節(jié)點(diǎn)相對(duì)位置。

?  Grid Layout：網(wǎng)格布局，所有節(jié)點(diǎn)排列成方形網(wǎng)格。

?  Hierarchical Layout：分層布局，展示網(wǎng)絡(luò)中的主要方向，節(jié)點(diǎn)被放置在按層次排列的層級(jí)中，通過(guò)最小化邊的交叉數(shù)量對(duì)每個(gè)層內(nèi)的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序。

?  Circular Layout：環(huán)形布局，強(qiáng)調(diào)網(wǎng)絡(luò)中的分組和樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)分析結(jié)構(gòu)的連通性對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分組，并將分組結(jié)果布局成單獨(dú)的圓，圓本身以放射狀樹(shù)形布局的方式進(jìn)行排列。

?  Stacked Node Layout：堆疊節(jié)點(diǎn)布局，將節(jié)點(diǎn)縱向堆疊排列進(jìn)行布局。

?  還有一些通過(guò)安裝插件實(shí)現(xiàn)的布局選項(xiàng)，根據(jù)實(shí)際效果選擇合適美觀的布局操作。

●Apps：應(yīng)用菜單。可以進(jìn)行插件管理，為已安裝的插件提供菜單選項(xiàng)。常用的插件有：

?  stringApp：從Cytoscape內(nèi)導(dǎo)入string-db的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。

?  MCODE：對(duì)網(wǎng)路中節(jié)點(diǎn)和邊進(jìn)行聚類分析。

?  CytoHubba：過(guò)濾互作網(wǎng)絡(luò)，篩選核心基因。

?  yFiles Layout Algorithms：更多網(wǎng)絡(luò)圖布局。

●Tools：工具菜單。包含多種高級(jí)功能，如下所示：

?  Analyze Network：網(wǎng)絡(luò)分析，查看節(jié)點(diǎn)、邊、連接的數(shù)量，網(wǎng)絡(luò)直徑、半徑、聚類系數(shù)等。

?  Enrichment Table：富集分析，需要有與查詢基因相關(guān)的物種及gene symbols。

?  Open Web Page：可以打開(kāi)瀏覽器窗口，快速查看Cytoscape特定網(wǎng)頁(yè)。在作圖時(shí)參考Cytoscape使用手冊(cè)的內(nèi)容。

●Help：幫助菜單?？梢圆榭从脩羰褂檬謨?cè)。

?  Citations：可以查看Cytoscape的主要參考文獻(xiàn)和已安裝插件的參考文獻(xiàn)。

2. 常用功能圖標(biāo)

這些功能也可以通過(guò)菜單使用。將鼠標(biāo)指針懸停在圖標(biāo)上，短暫停留將會(huì)顯示該工具的提示信息，右擊工具欄可以自定義內(nèi)容。

a.從Network Data Exchange (NDEx)中導(dǎo)入或?qū)С鼍W(wǎng)絡(luò)。

b.打開(kāi)或保存網(wǎng)絡(luò)文件（.cys）。

c.從文件中導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)或?qū)氡砀?，添加到目前的網(wǎng)絡(luò)中。

d.針對(duì)網(wǎng)路主視圖窗口的可視化操作，放大、縮小、適配屏幕、選擇部分節(jié)點(diǎn)適配屏幕。

e.恢復(fù)網(wǎng)絡(luò)的初始狀態(tài)。

f.找到選中節(jié)點(diǎn)的鄰近節(jié)點(diǎn)，可以多次點(diǎn)擊；隱藏選中節(jié)點(diǎn)和邊；顯示被隱藏的節(jié)點(diǎn)和邊。

g.使用選擇的節(jié)點(diǎn)和邊形成自網(wǎng)絡(luò)。

h.富集分析。

3. 網(wǎng)絡(luò)面板

修改節(jié)點(diǎn)、邊、網(wǎng)絡(luò)的樣式，包括顏色、節(jié)點(diǎn)大小、字體、形狀等，也可以修改網(wǎng)絡(luò)圖整體背景顏色。

4.顯示網(wǎng)絡(luò)的主網(wǎng)絡(luò)視圖窗口

顯示網(wǎng)絡(luò)圖，可以同時(shí)顯示多個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖窗口，網(wǎng)絡(luò)視圖底部是一系列視圖工具。將鼠標(biāo)指針懸停在圖標(biāo)上，短暫停留將會(huì)顯示該工具的提示信息。

a.將所有已經(jīng)加載的網(wǎng)絡(luò)以網(wǎng)格樣式排列各個(gè)窗口視圖；顯示當(dāng)前選擇的網(wǎng)絡(luò)。

b.獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)視圖窗口，將網(wǎng)絡(luò)圖窗口與軟件主窗口分開(kāi)。

c.導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)絡(luò)圖。

d.強(qiáng)制渲染圖形細(xì)節(jié)（默認(rèn)關(guān)閉）；關(guān)閉或打開(kāi)節(jié)點(diǎn)選擇；關(guān)閉或打開(kāi)邊選擇；關(guān)閉或打開(kāi)注釋選擇；關(guān)閉或打開(kāi)節(jié)點(diǎn)或邊的標(biāo)簽選擇。后四個(gè)選項(xiàng)影響你在視圖窗口中是否能選擇拖動(dòng)節(jié)點(diǎn)、選擇邊，移動(dòng)節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽等。

e.隱藏鳥(niǎo)瞰視圖。在大型網(wǎng)絡(luò)圖中方便查看每個(gè)位置的節(jié)點(diǎn)。

5.表格面板

顯示節(jié)點(diǎn)和邊的數(shù)據(jù)，可以修改相應(yīng)數(shù)據(jù)。導(dǎo)入或?qū)С霰砀?，添加或刪除表，還可以篩選想要顯示的列。

6.命令面板

可以讀取和執(zhí)行腳本文件，文件中每行為發(fā)送到應(yīng)用的命令。

Part 3  插件下載與安裝

插件可以直接在Cytoscape App Store進(jìn)行搜索下載。

也可以在Cytoscape中的App Store →Show App Store中進(jìn)行查找，跳轉(zhuǎn)對(duì)應(yīng)插件網(wǎng)頁(yè)，相比直接的網(wǎng)頁(yè)搜索效果更精確，網(wǎng)頁(yè)搜索會(huì)將包含相應(yīng)單詞的插件都顯示出來(lái)。

進(jìn)入網(wǎng)頁(yè)后下載插件文件，下載好后回到Cytoscape，選擇Install Apps From File 進(jìn)行安裝。這里我們安裝了stringApp、MCODE和CytoHubba，嘗試復(fù)原文獻(xiàn)中的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的樣式。

Part 4  蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖繪制

首先我們可以下載得到開(kāi)頭文章中所用的互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，如圖，Table 5中是作者構(gòu)建的12個(gè)差異miRNA驗(yàn)證靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中，3個(gè)（hsa-miR-4505, hsa-miR-4743-5p, hsa-miR-6846-5p）上調(diào)，共341個(gè)靶基因，9 個(gè)（hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-4668-5p, hsa-miR-4706, hsa-miR-6511b-5p, hsa-miR-6750-5p, hsa-miR-4750-3p, hsa-miR-320e, hsa-miR-4717-3p, hsa-miR-7850-5p）下調(diào)，共1991個(gè)靶基因。這里我們用上調(diào)的miRNAs涉及到的靶基因進(jìn)行作圖，共341個(gè)。

第一步：使用Cytoscape中的STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定網(wǎng)絡(luò)圖存在的節(jié)點(diǎn)和邊。

1. 通過(guò)File→Import→Network from Public Databases，導(dǎo)入互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.切換至STRING：protein query，選擇對(duì)應(yīng)物種，輸入靶基因列表，其余參數(shù)可以保持默認(rèn)狀態(tài)，也可以根據(jù)需要自行選則。

其中Network type是指網(wǎng)絡(luò)類型，默認(rèn)選擇full STRING network，指保留全部來(lái)源的互作網(wǎng)絡(luò)，既有實(shí)際證據(jù)證明的，也包含基于臨近基因、文本檢索、共表達(dá)、共定位等預(yù)測(cè)的可能存在的蛋白相互作用。 physical subnetwork則僅保留存在實(shí)質(zhì)結(jié)合或形成蛋白復(fù)合體的相互作用。Confidence (score) cutoff指互作置信度篩選值，在STRING中，0.4為中等可信度，0.7為高可信度，0.9為最高可信度，0.15為較低可信度。Maximum additional interactors 指附加的互作蛋白數(shù)量最大值，最多可添加的互作數(shù)量，可以將原始查詢中未包含但預(yù)測(cè)到會(huì)發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)添加到網(wǎng)絡(luò)中。Use Smart Delimiters可以使用只能分隔符正確分隔輸入的蛋白質(zhì)名稱和標(biāo)識(shí)符。Load Enrichment Data指加載富集數(shù)據(jù)對(duì)蛋白進(jìn)行富集分析。

3.導(dǎo)入后即可獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，可以通過(guò)右側(cè)選項(xiàng)更改圖片呈現(xiàn)樣式，修改標(biāo)識(shí)符位置，隱藏或顯示單獨(dú)節(jié)點(diǎn)，點(diǎn)擊任意節(jié)點(diǎn)可以查看對(duì)應(yīng)蛋白的描述和結(jié)構(gòu)。

還可以通過(guò)Tools→Analyze Network分析網(wǎng)絡(luò)，查看點(diǎn)和邊的數(shù)量等信息。

第二步：使用Cytoscape中的MCODE 插件，對(duì)所有節(jié)點(diǎn)和邊進(jìn)行聚類分析。

1. 首先打開(kāi)Apps→MCODE，參數(shù)一般維持默認(rèn)即可。其中，F(xiàn)ind Clusters，可以從全部網(wǎng)絡(luò)圖中尋找，也可以從選定的節(jié)點(diǎn)和邊中尋找。Include Loops，選擇后MCODE會(huì)包含循環(huán)的邊(self-edges)。Degree Cutoff指對(duì)節(jié)點(diǎn)評(píng)分的最小連接數(shù)，如僅與另一個(gè)節(jié)點(diǎn)共享一個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree值為1，有效最小數(shù)值為2，防止單連接節(jié)點(diǎn)人為的獲得高節(jié)點(diǎn)數(shù)。Haircut，指一些滿足Degree Cutoff的節(jié)點(diǎn)可能僅通過(guò)一條邊連接到集群，Haircut會(huì)刪除這類單連接節(jié)點(diǎn)。K-Core：過(guò)濾掉不包含最少K 值的最大互連子集群的集群，子集群中的節(jié)點(diǎn)degree都要大于K。 Max.Depth：子節(jié)點(diǎn)到集群中其他節(jié)點(diǎn)的距離，MCODE可以在該距離內(nèi)搜索集群的子節(jié)點(diǎn)。

分析完成后，可以把每個(gè)自網(wǎng)絡(luò)單獨(dú)輸出，進(jìn)行調(diào)整。

可以通過(guò)Layout，選擇合適的布局輸出保存成圖片或文件。

第三步：使用Cytoscape中的cytoHubba  插件，過(guò)濾 PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選核心基因。

1.點(diǎn)擊左側(cè)的cytoHubba工作區(qū)，選擇目標(biāo)分析網(wǎng)絡(luò)，點(diǎn)擊calculate，選擇關(guān)鍵基因數(shù)量排名靠前的十個(gè)，使用BottleNeck算法進(jìn)行分析，或者選擇感興趣的基因。

2.核心基因結(jié)果顯示如下，右邊列表為核心基因排名，顏色越深分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明這個(gè)基因越顯著。可以通過(guò)style中的各項(xiàng)修改網(wǎng)絡(luò)圖樣式，這里我們修改了圖中標(biāo)識(shí)的顯示內(nèi)容，可以看出PTEN同文章中一樣，是上調(diào)miRNA中的關(guān)鍵核心基因。

3.同樣的，我們可以調(diào)整網(wǎng)絡(luò)圖布局進(jìn)行輸出，得到如下結(jié)果：

本次Cytoscape使用介紹就到這里，更多介紹可以查看中文手冊(cè)以及相關(guān)插件的對(duì)應(yīng)使用手冊(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1] Szyde?ko J, Czop M, et al. Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study. Cardiovasc Diabetol. 2024;23(1):278.

[2] Locard-Paulet, Marie et al.Functional Analysis of MS-Based Proteomics Data: From Protein Groups to Networks.Molecular & Cellular Proteomics, Volume 23, Issue 12, 100871.