在生命微觀尺度下，蛋白質(zhì)是極為關(guān)鍵的生物大分子，廣泛參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)維系、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝催化、信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控等生命活動(dòng)，是生命活動(dòng)的重要基石。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮依賴蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI），PPI參與細(xì)胞內(nèi)眾多生理過(guò)程，如基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控等。以信號(hào)傳導(dǎo)為例，細(xì)胞接收信號(hào)后通過(guò)蛋白質(zhì)間有序的相互作用傳遞放大信號(hào)，引發(fā)生理響應(yīng)，因此PPI是細(xì)胞正常生理功能實(shí)現(xiàn)的核心機(jī)制，異常時(shí)易引發(fā)多種疾病。探究其作用機(jī)制和規(guī)律是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要課題。

蛋白質(zhì)相互作用可以分為穩(wěn)定相互作用和瞬時(shí)相互作用兩種類型。這兩種類型的相互作用均存在強(qiáng)弱差異。

穩(wěn)定相互作用主要存在于多亞基復(fù)合物中，這類相互作用可通過(guò)免疫共沉淀或Pull down等方法鑒定。

瞬時(shí)相互作用參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾、運(yùn)輸、折疊、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期等多數(shù)生理過(guò)程，通常作為生理過(guò)程的“分子開關(guān)"發(fā)揮臨時(shí)調(diào)控作用，其結(jié)合強(qiáng)度可強(qiáng)可弱、作用時(shí)間可長(zhǎng)可短，但一般需要特定條件觸發(fā)。瞬時(shí)相互作用可通過(guò)交聯(lián)或標(biāo)記轉(zhuǎn)移等方法來(lái)檢測(cè)。

接下來(lái)我們一起了解在生命科學(xué)研究中檢測(cè)蛋白間相互作用的常用方法。

一、酵母雙雜交（Y2H）

（一）技術(shù)簡(jiǎn)介

酵母雙雜交技術(shù)是蛋白互作研究的經(jīng)典方法，起源于20世紀(jì)80年代末。它利用酵母轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）的結(jié)構(gòu)特征檢測(cè)蛋白互作——這類轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）組成，僅當(dāng)二者空間靠近時(shí)才能激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。在該系統(tǒng)中，將待檢測(cè)的兩種蛋白分別與BD、AD融合，構(gòu)建成誘餌蛋白（BD-靶蛋白）和獵物蛋白（AD-待測(cè)蛋白）并導(dǎo)入酵母細(xì)胞表達(dá)。若兩種蛋白發(fā)生互作，BD與AD將在空間上靠近，使BD結(jié)合到報(bào)告基因上游的激活序列（UAS），同時(shí)AD激活下游報(bào)告基因（如HIS3、LEU2等營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因或β-半乳糖苷酶基因）的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)觀察酵母在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，或檢測(cè)β-半乳糖苷酶的顯色活性（如X-Gal染色），即可判斷蛋白間是否存在互作。

（二）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 在構(gòu)建載體時(shí)，要確保融合蛋白的正確表達(dá)，避免因基因插入錯(cuò)誤或表達(dá)異常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；

2. 要對(duì)誘餌蛋白進(jìn)行自激活檢測(cè)，防止其自身激活報(bào)告基因，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；

3. 在篩選文庫(kù)時(shí)，要設(shè)置合適的對(duì)照，如陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以準(zhǔn)確判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

4. 由于酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，所以要保證酵母感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量，操作過(guò)程也要嚴(yán)格按照無(wú)菌要求進(jìn)行，防止雜菌污染。

（三）優(yōu)勢(shì)與局限

?優(yōu)勢(shì)：

1. 高通量篩選能力：可從 cDNA 文庫(kù)（含數(shù)萬(wàn)克?。┲写笠?guī)模篩選互作蛋白，適用構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)；

2. 模擬體內(nèi)環(huán)境：在酵母細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)互作，保留蛋白折疊與核定位等生理?xiàng)l件，適合核蛋白互作分析；

3. 操作簡(jiǎn)便：無(wú)需純化蛋白，通過(guò)報(bào)告基因（如營(yíng)養(yǎng)缺陷、顯色反應(yīng)）表型篩選，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用；

4. 檢測(cè)直接互作：可鑒定蛋白間的直接相互作用，無(wú)需依賴第三方因子（如抗體）。

?局限：

1. 假陽(yáng)性/假陰性率高：約30%-50%陽(yáng)性克隆為非特異性互作（如自激活現(xiàn)象），膜蛋白、分泌蛋白等因無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核易漏檢；

2. 依賴蛋白表達(dá)與定位：核蛋白互作檢測(cè)效率高，胞質(zhì)/膜蛋白需進(jìn)行特殊改造（如使用膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)）；

3. 無(wú)法檢測(cè)動(dòng)態(tài)互作：報(bào)告基因表達(dá)需數(shù)小時(shí)至數(shù)天，難以捕捉瞬時(shí)/弱互作（如信號(hào)通路中的動(dòng)態(tài)結(jié)合）；

4. 物種局限性：哺乳動(dòng)物蛋白可能因糖基化、磷酸化等翻譯后修飾差異，可能導(dǎo)致互作失敗。

二、免疫共沉淀（Co-IP）

（一）技術(shù)簡(jiǎn)介

免疫共沉淀（Co-IP）是在細(xì)胞裂解液體系中驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，能在細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下捕獲相互作用的蛋白質(zhì)。其原理是基于抗體對(duì)目標(biāo)蛋白表位的特異性識(shí)別。細(xì)胞裂解后，向裂解液加入針對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性抗體，抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物，再利用能與抗體Fc段特異性結(jié)合的介質(zhì)（如ProteinA/G瓊脂糖珠）沉淀免疫復(fù)合物。經(jīng)多次洗滌去除雜質(zhì)蛋白，最后用Western Blotting分析沉淀所得的蛋白復(fù)合物，或者使用質(zhì)譜檢測(cè)與目標(biāo)蛋白相互作用的潛在蛋白。

（二）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 抗體選擇：使用高特異性、高親和力的IP抗體，可通過(guò)Western blot預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的表位識(shí)別能力，驗(yàn)證無(wú)明顯非特異性條帶。需根據(jù)抗體種屬選擇匹配的 Protein A/G 介質(zhì)，避免因Fc段結(jié)合效率低導(dǎo)致沉淀失敗。

2. 樣品制備：使用新鮮細(xì)胞或組織（避免反復(fù)凍融），根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇裂解液（如NP-40或RIPA），添加蛋白酶/磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解或修飾丟失，裂解后迅速離心取上清，去除細(xì)胞碎片。

3. 對(duì)照設(shè)置：陰性對(duì)照：同型IgG或空載體轉(zhuǎn)基因材料；Input對(duì)照：驗(yàn)證目標(biāo)蛋白在樣品中表達(dá)。

4. 結(jié)合條件優(yōu)化：調(diào)整抗體和磁珠/瓊脂糖的比例，避免過(guò)量抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合，優(yōu)化孵育時(shí)間（通常4℃過(guò)夜）和溫度。

5. 洗滌條件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整洗滌緩沖液鹽濃度，如用含 Triton X-100的低鹽/高鹽緩沖液（如PBS+0.1%Triton X-100）梯度洗滌，去除非特異性結(jié)合，同時(shí)避免強(qiáng)洗滌條件破壞蛋白復(fù)合物。

（三）優(yōu)勢(shì)與局限

?優(yōu)勢(shì)：

1. 生理相關(guān)性強(qiáng)：在細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下檢測(cè)蛋白互作，保留翻譯后修飾（如磷酸化、泛素化）和亞細(xì)胞定位信息，更貼近生理環(huán)境（區(qū)別于體外Pull-down技術(shù)）。

2. 樣本適用性廣：可用于細(xì)胞裂解液、組織樣本（如冰凍/石蠟切片組織提取液），甚至轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的體液樣本，兼容內(nèi)源蛋白和外源表達(dá)蛋白的檢測(cè)。

3. 操作兼容性高：結(jié)合質(zhì)譜（MS）可篩選未知互作蛋白，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)WB能特異性驗(yàn)證已知互作蛋白。

?局限：

1. 間接互作干擾：檢測(cè)到的蛋白復(fù)合物可能是通過(guò)第三方因子連接的間接結(jié)合，無(wú)法直接證明兩蛋白的物理結(jié)合，需結(jié)合體外Pull-down實(shí)驗(yàn)或酵母雙雜交驗(yàn)證直接互作。

2. 低豐度蛋白限制：對(duì)低表達(dá)蛋白的敏感性不足，需要增加樣本投入量或借助交聯(lián)劑固定（但可能增加非特異性結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)）。

3. 抗體依賴性強(qiáng)：抗體質(zhì)量直接影響結(jié)果，可能漏檢某些互作（如表位被遮蔽）或產(chǎn)生假陽(yáng)性（非特異性結(jié)合）。

4. 動(dòng)態(tài)互作捕捉難：難以捕獲瞬時(shí)或弱相互作用（如激酶-底物的短暫結(jié)合），需優(yōu)化孵育時(shí)間或使用交聯(lián)劑（如甲醛）固定。

三、蛋白Pull-down

（一）技術(shù)簡(jiǎn)介

Pull-down實(shí)驗(yàn)是體外研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，基于親和層析原理，能捕獲并鑒定與目標(biāo)蛋白（誘餌蛋白）相互作用的其他蛋白。流程為：先將誘餌蛋白與特定標(biāo)簽（如GST、His、Halo、Flag等）融合表達(dá)，利用親和層析純化融合蛋白，隨后，將純化的融合蛋白通過(guò)標(biāo)簽與固相支持物上配體特異性結(jié)合，形成固定化的誘餌蛋白。然后將含獵物蛋白的細(xì)胞裂解液或蛋白溶液，與固定化誘餌蛋白孵育，通過(guò)洗去未結(jié)合蛋白，捕獲具有相互作用的蛋白復(fù)合物。最后洗脫分離結(jié)合的蛋白復(fù)合物，可使用Western Blotting驗(yàn)證已知互作蛋白或質(zhì)譜分析篩選未知互作蛋白。

（二）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 蛋白表達(dá)純化：根據(jù)需求選擇原核（如E.coli，表達(dá)需注意蛋白可溶性，避免包涵體形成）或者真核（如HEK293、昆蟲細(xì)胞等，適合復(fù)雜修飾的蛋白）表達(dá)系統(tǒng)。

2. 樣本制備：裂解液的成分需根據(jù)研究對(duì)象進(jìn)行優(yōu)化，過(guò)高濃度的去垢劑可能破壞蛋白-配體的相互作用，樣本需充分離心或過(guò)濾，去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。

3. 配體與基質(zhì)選擇：配體的親和力和特異性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選最佳配體；基質(zhì)應(yīng)選擇非特異性吸附低的類型，并嚴(yán)格控制配體的偶聯(lián)效率和密度。

4. 對(duì)照設(shè)置：設(shè)置陰性對(duì)照（如空載表達(dá)的蛋白或無(wú)關(guān)配體），陽(yáng)性對(duì)照（已知與配體結(jié)合的蛋白），input對(duì)照（同步檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)量，確保樣本制備一致性），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

（三）優(yōu)勢(shì)與局限

?優(yōu)勢(shì)：

1. 無(wú)需抗體：僅需將誘餌蛋白標(biāo)記（如GST、His等標(biāo)簽），避免因抗體特異性差或者制備困難導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)阻礙，尤其適用于無(wú)商業(yè)化抗體的蛋白研究。

2. 靈活性高：可精準(zhǔn)設(shè)計(jì)誘餌蛋白的突變體、結(jié)構(gòu)域或翻譯后修飾（如磷酸化位點(diǎn)突變），研究結(jié)構(gòu)、修飾等對(duì)互作的影響。

3. 樣本兼容性廣：適用于原核/真核表達(dá)蛋白、細(xì)胞裂解液、合成多肽（如抗原表位肽），或者化學(xué)合成的小分子配體。

4. 應(yīng)用范圍廣：可用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、小分子化合物、核酸等多種配體的相互作用，在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、信號(hào)通路機(jī)制研究等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

?局限：

1. 非特異性背景干擾：配體或基質(zhì)可能非特異性吸附蛋白，導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)。需通過(guò)陰性對(duì)照（空標(biāo)簽基質(zhì)）和BSA封閉基質(zhì)降低背景。

2. 低豐度蛋白檢測(cè)困難：對(duì)于細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)的蛋白質(zhì)，由于親和捕獲效率有限，可能難以有效富集，影響檢測(cè)靈敏度。

3. 無(wú)法區(qū)分直接與間接相互作用：實(shí)驗(yàn)捕獲的蛋白復(fù)合物中，可能包含與目標(biāo)蛋白間接結(jié)合的蛋白，需要進(jìn)一步進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證兩蛋白是否直接互作。

4. 動(dòng)態(tài)互作捕捉難：體外孵育時(shí)間通常 2-4 小時(shí)，無(wú)法模擬細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)互作（如激酶 - 底物結(jié)合僅數(shù)秒）。

5. 表達(dá)系統(tǒng)限制：原核表達(dá)缺乏真核修飾（如糖基化），可能影響互作真實(shí)性，可采用無(wú)細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)保留翻譯后修飾。藍(lán)景科信為您提供無(wú)細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)選擇，表達(dá)成功率高，周期短，表達(dá)蛋白更接近體內(nèi)蛋白情況。

四、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）

（一）技術(shù)簡(jiǎn)介

雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)能直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用。其原理是將熒光蛋白（如綠色熒光蛋GFP、黃色熒光蛋YFP 等）在特定位點(diǎn)分割成無(wú)熒光活性的N端和C端片段，再將這兩個(gè)片段分別與待測(cè)的兩種目標(biāo)蛋白融合，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化導(dǎo)入活細(xì)胞表達(dá)。當(dāng)目標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)帶動(dòng)兩個(gè)熒光蛋白片段靠近重組，恢復(fù)熒光活性并發(fā)光。借助熒光顯微鏡能直接觀測(cè)熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的位置和強(qiáng)度，從而確定蛋白間的相互關(guān)系及其亞細(xì)胞定位。

（二）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 載體設(shè)計(jì)優(yōu)化：在目標(biāo)蛋白與熒光片段之間添加柔性連接肽，通過(guò)增加空間自由度減少熒光片段對(duì)蛋白互作的位阻效應(yīng)，避免干擾蛋白功能。 

2. 表達(dá)水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽(yáng)性，平衡兩種蛋白表達(dá)效率。 

3. 嚴(yán)格對(duì)照：設(shè)單獨(dú)片段對(duì)照，排除片段自發(fā)互補(bǔ)的可能，添加陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

4. 檢測(cè)條件：熒光信號(hào)通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時(shí)間，建議在24-48小時(shí)內(nèi)完成成像，避免超過(guò)72小時(shí)因蛋白過(guò)飽和聚集產(chǎn)生假陽(yáng)性，針對(duì)不同熒光蛋白設(shè)置合適激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。 

（三）優(yōu)勢(shì)與局限

?優(yōu)勢(shì)：

1. 直觀可視化：通過(guò)熒光顯微鏡（如共聚焦）實(shí)時(shí)觀測(cè)蛋白互作的亞細(xì)胞定位（如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)囊泡等），直接關(guān)聯(lián)互作事件與細(xì)胞功能區(qū)域。

2. 高特異性：僅當(dāng)兩蛋白距離<10 nm時(shí)，熒光蛋白N/C端片段才能重構(gòu)成完整β-barrel構(gòu)并恢復(fù)熒光，降低假陽(yáng)性。

3. 適用于弱/瞬時(shí)互作：熒光互補(bǔ)后形成穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)，可將短暫互作（如激酶-底物結(jié)合數(shù)秒）轉(zhuǎn)化為持續(xù)熒光信號(hào)，通過(guò)累計(jì)效應(yīng)提升檢測(cè)靈敏度。

4. 多系統(tǒng)兼容：動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞及模式生物體內(nèi)均可應(yīng)用，適用于原生質(zhì)體、組織切片及活體幼體等多種樣本類型。

5. 多色擴(kuò)展應(yīng)用：利用不同光譜的熒光蛋白（如GFP/YFP/CFP/RFP），通過(guò)光譜拆分技術(shù)實(shí)現(xiàn)2-3對(duì)互作的同時(shí)可視化分析。

?局限：

1. 不可逆互補(bǔ)：熒光蛋白互補(bǔ)后形成共價(jià)或非共價(jià)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，無(wú)法反映動(dòng)態(tài)解離過(guò)程。

2. 假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)：過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致蛋白非生理性聚集或片段自發(fā)互補(bǔ)（需單轉(zhuǎn)片段對(duì)照）。

3. 靈敏度限制：弱互作可能信號(hào)微弱，需搭配高靈敏度設(shè)備（如共聚焦顯微鏡）或信號(hào)放大系統(tǒng)（如mCherry標(biāo)簽串聯(lián)）。

4. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光蛋白片段插入可能影響目標(biāo)蛋白的折疊或亞細(xì)胞定位。

5. 光穩(wěn)定性問(wèn)題：常用熒光蛋白（GFP/YFP）在高強(qiáng)度光照下易發(fā)生光漂白（半衰期約 5-10 分鐘），需采用低光強(qiáng)成像+快速掃描或添加抗淬滅劑。

五、熒光素酶互補(bǔ)（LCI）

（一）技術(shù)簡(jiǎn)介

熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)基于熒光素酶的特性來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用。原理是將熒光蟲熒光素酶（如Firefly luciferase）拆分成兩個(gè)無(wú)活性的N端和C端片段，再分別與待檢測(cè)的兩種目標(biāo)蛋白融合表達(dá)。當(dāng)目標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，兩個(gè)熒光素酶片段靠近重構(gòu)為有活性的酶，再加入熒光素底物可催化底物反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度即可判斷蛋白間是否存在相互作用及作用強(qiáng)度。

（二）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 載體設(shè)計(jì)優(yōu)化：在目標(biāo)蛋白與熒光素酶片段之間添加柔性連接肽，通過(guò)增加空間自由度減少位阻效應(yīng)，避免干擾蛋白功能。 

2. 表達(dá)水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽(yáng)性，平衡兩種蛋白表達(dá)效率。 

3. 嚴(yán)格對(duì)照：設(shè)單獨(dú)片段對(duì)照，排除片段自發(fā)互補(bǔ)的可能，添加陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

4. 檢測(cè)條件：熒光信號(hào)通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時(shí)間，建議在24-48小時(shí)內(nèi)完成成像，避免超過(guò)72小時(shí)因蛋白過(guò)飽和聚集產(chǎn)生假陽(yáng)性。發(fā)光信號(hào)半衰期約30分鐘，需在添加底物后5-10分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，并設(shè)置復(fù)孔（n≥3）降低誤差。 

（三）優(yōu)勢(shì)與局限

?優(yōu)勢(shì)：

1. 高靈敏度：可檢測(cè)弱或瞬時(shí)互作（如NanoLuc信號(hào)強(qiáng)度比Firefly高100倍）。

2. 定量性強(qiáng)：化學(xué)發(fā)光信號(hào)線性達(dá)7-8個(gè)數(shù)量級(jí)，適用于定量分析互作親和力及藥物對(duì)互作的抑制/激活效應(yīng)）。

3. 活細(xì)胞/體內(nèi)應(yīng)用：適用于植物（如煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)） 和動(dòng)物模型（如小鼠腫瘤細(xì)胞活體成像）。

4. 無(wú)自發(fā)熒光干擾：生物發(fā)光無(wú)需激發(fā)光，避免細(xì)胞自發(fā)熒光（如葉綠素、膠原蛋白）和熒光蛋白的光漂白問(wèn)題。

?局限：

1. 不可逆互補(bǔ)：熒光素酶片段互補(bǔ)后形成穩(wěn)定的催化構(gòu)象，解離半衰期>24小時(shí)，無(wú)法反映生理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)解離過(guò)程（如激酶-底物的互作）。

2. 過(guò)表達(dá)假陽(yáng)性：高濃度蛋白可能導(dǎo)致非生理性聚集（需控制表達(dá)量并驗(yàn)證內(nèi)源互作，設(shè)置單轉(zhuǎn)片段對(duì)照）。

3. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光素酶片段融合可能影響目標(biāo)蛋白的折疊或亞細(xì)胞定位。

4. 光穩(wěn)定性問(wèn)題：發(fā)光信號(hào)在添加底物后30分鐘內(nèi)衰減50%（如螢火蟲熒光素酶），需在5-15分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，不適合長(zhǎng)時(shí)間互作追蹤。

六、表面等離子共振（SPR）

（一）技術(shù)簡(jiǎn)介

SPR是一種基于光學(xué)原理的無(wú)標(biāo)記生物分子相互作用分析技術(shù)，核心原理是：

當(dāng)一束偏振光以臨界角入射到玻璃棱鏡與金屬膜（通常為金膜）的界面時(shí)，會(huì)發(fā)生全反射并產(chǎn)生消逝波。若金屬膜表面固定的靶分子（如受體、抗體）與溶液中的分析物（如配體、抗原）發(fā)生結(jié)合，會(huì)引起金屬膜表面的折射率變化，進(jìn)而導(dǎo)致反射光的共振角偏移。通過(guò)監(jiān)測(cè)共振角偏移量（ΔRU，響應(yīng)單位），可實(shí)時(shí)定量分析分子間的結(jié)合/解離動(dòng)力學(xué)過(guò)程及親和力強(qiáng)弱。

1.核心組件

2. 關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)

響應(yīng)單位（RU）：1RU≈1ng/mm2 的分子質(zhì)量變化，反映結(jié)合分子的量。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)：

結(jié)合相（Association）：分析物與靶分子結(jié)合的速率（k_on，單位：M?1?s?1）。

解離相（Dissociation）：結(jié)合復(fù)合物解離的速率（k_off，單位：s?1）。

平衡解離常數(shù)（KD）：反映親和力，KD越小，親和力越強(qiáng)（如KD<10^?9M為高親和力）。

檢測(cè)范圍：可檢測(cè)低至nM級(jí)的親和力（如瞬時(shí)互作）和快至秒級(jí)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

（二）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 在固定配體時(shí)，要保證配體的活性和固定的穩(wěn)定性，避免配體在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中脫落或失活。同時(shí)，要優(yōu)化樣品的濃度和流速，以獲得最佳的信號(hào)響應(yīng) 。

2. 由于SPR信號(hào)容易受到外界環(huán)境因素的影響，如溫度、溶液中的雜質(zhì)等，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要保持環(huán)境的穩(wěn)定，使用高質(zhì)量的緩沖液和純凈的樣品。

3. 在數(shù)據(jù)分析時(shí)，要選擇合適的擬合模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛿?shù)據(jù)特點(diǎn)進(jìn)行參數(shù)計(jì)算，避免因模型選擇不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果偏差 。

（三）優(yōu)勢(shì)與局限

?優(yōu)勢(shì)：

1. 無(wú)標(biāo)記：無(wú)需熒光/同位素標(biāo)記，保留分子天然構(gòu)象。

2. 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)：直接監(jiān)測(cè)結(jié)合-解離全過(guò)程，提供動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3. 高靈敏度：可檢測(cè)低至pg級(jí)的分子結(jié)合（如單克隆抗體）。

4. 高通量：搭配自動(dòng)進(jìn)樣器可實(shí)現(xiàn)批量樣品分析。

?局限：

1. 需純化分子：靶蛋白和分析物需高度純化（不適用于細(xì)胞裂解液等復(fù)雜體系）。

2. 儀器成本高：商用SPR設(shè)備（如Biacore系列）價(jià)格通常在百萬(wàn)級(jí)別。

3. 固定效應(yīng)：靶蛋白固定可能影響其構(gòu)象，導(dǎo)致假陰性 / 假陽(yáng)性結(jié)果。

蛋白互作不同方法的比較

上述介紹了6種常用的蛋白質(zhì)互作研究方法。不同技術(shù)的檢測(cè)原理、實(shí)驗(yàn)條件及靈敏度存在差異，可能導(dǎo)致結(jié)果不一致。建議根據(jù)研究目標(biāo)（如篩選、驗(yàn)證、定量或定位）和樣品特性（如蛋白亞細(xì)胞定位、互作強(qiáng)弱），選擇單一方法或聯(lián)合多種技術(shù)交叉驗(yàn)證。