2025年10月25日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心喻德躍教授團(tuán)隊(duì)在Plant Biotechnology Journal（IF: 10.5）上在線發(fā)表了題為GmMYB4 Positively Regulates Isoflavone Biosynthesis via the GmMAPK6-GmMYB4-MBW Module in Soybean的研究論文，通過DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，從多維度系統(tǒng)解析了轉(zhuǎn)錄因子GmMYB4調(diào)控大豆異黃酮生物合成的分子機(jī)制，揭示GmMAPK6-GmMYB4-MBW調(diào)控模塊在異黃酮代謝網(wǎng)絡(luò)中的核心作用，為高異黃酮含量大豆品種培育提供關(guān)鍵理論依據(jù)與基因資源。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq和RNA-seq技術(shù)支持。

大豆是重要的糧飼兼用和油料作物，富含異黃酮、皂苷等多種生物活性物質(zhì)。其中異黃酮作為豆科植物的生物活性成分，兼具抗氧化、抗炎及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等功能，對(duì)優(yōu)化大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)至關(guān)重要。其含量精準(zhǔn)調(diào)控一直是大豆育種領(lǐng)域的核心目標(biāo)。

大豆異黃酮是豆科植物的次生代謝產(chǎn)物，其合成依賴苯丙烷途徑的分支路徑，與花青素合成共享前體物質(zhì)（如柚皮素），形成 “代謝競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系"。此前研究已發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是異黃酮合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，但這類因子如何通過復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)精準(zhǔn)調(diào)控異黃酮含量，尤其是與其他信號(hào)通路（如MAPK信號(hào)）的協(xié)同機(jī)制，仍存在大量未知。

主要研究結(jié)果

核心發(fā)現(xiàn)一：GmMYB4——異黃酮合成的“正向調(diào)控開關(guān)"

1. GWAS定位候選基因GmMYB4

為挖掘調(diào)控大豆異黃酮含量的關(guān)鍵基因，本研究收集了219份大豆種質(zhì)資源在三種不同環(huán)境環(huán)境下的總異黃酮含量（TIC）、染料木黃酮類含量（GEC）、大豆苷元類含量（DAC）及黃豆黃素類含量（GLC）數(shù)據(jù)，并開展全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），在11號(hào)染色體8.15-8.27 Mb區(qū)間鎖定231個(gè)顯著SNP，并最終篩選出GmMYB4（Glyma.11g107100）作為核心候選基因——該基因?qū)儆赗2R3-MYB家族，與擬南芥中調(diào)控類黃酮合成的MYB4同源。通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)：攜帶GmMYB4^H1單倍型的大豆材料，其GLC含量在三年環(huán)境中均顯著高于H2單倍型材料，證明GmMYB4^H1是調(diào)控異黃酮的“優(yōu)異單倍型"。

2. GmMYB4基因功能驗(yàn)證

為確認(rèn)GmMYB4的功能，通過構(gòu)建大豆毛狀根過表達(dá)與RNAi干涉體系，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因過表達(dá)株系和CRISPR/Cas9敲除突變體，結(jié)合RT-qPCR與代謝物（TIC、GEC、DAC、GLC）含量測(cè)定，結(jié)果顯示過表達(dá)株系異黃酮總含量及各組分含量顯著提升，敲除突變體株系顯著下降，證實(shí)GmMYB4為大豆異黃酮生物合成的正向調(diào)控因子。

值得注意的是，大豆基因組中存在GmMYB4的同源基因Glyma.12g032200，雙基因敲除后GLC含量驟降97%，遠(yuǎn)高于單敲除效果，證明同源基因存在“功能補(bǔ)償效應(yīng)"。

圖1 大豆中GLC相關(guān)基因位點(diǎn)的鑒定與分析。

圖2 GmMYB4單倍型分析及初步功能驗(yàn)證。

核心發(fā)現(xiàn)二：GmMYB4 通過“干擾MBW復(fù)合體"平衡異黃酮與花青素合成

1. GmMYB4調(diào)控分子機(jī)制探究

研究團(tuán)隊(duì)對(duì)GmMYB4過表達(dá)株系、敲除突變體及WT材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），發(fā)現(xiàn)GmMYB4在調(diào)控代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其對(duì)類黃酮和異黃酮的生物合成途徑調(diào)控作用顯著。RT-qPCR結(jié)果顯示，異黃酮生物合成途徑中的7個(gè)關(guān)鍵基因（GmPAL1.3、GmC4H、GmCHS8、GmCHR1、GmCHI1、GmIFS2 和GmIFS1）在GmMYB4過表達(dá)株系中顯著上調(diào)，在gmmyb4突變體中則顯著下調(diào)。

此外，過表達(dá)GmIFS2導(dǎo)致R2期（盛花期）葉片和R8期（完熟期）種子中總異黃酮（TIC）含量顯著增加，與異黃酮生物合成存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的基因GmANS3呈現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢(shì)。這些結(jié)果表明表明GmMYB4不僅能調(diào)控異黃酮生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量及異黃酮含量，同時(shí)還能抑制花青素代謝途徑。

通過DAP-seq鑒定到GmMYB4的核心結(jié)合基序?yàn)?′-CACCTAAC-3′，同時(shí)進(jìn)行了EMSA驗(yàn)證了GmMYB4與motif序列的結(jié)合。DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析最終鑒定出1477個(gè)潛在靶基因，并富集于類黃酮生物合成通路。GmMYB4過表達(dá)株系種子類黃酮與原花青素含量較WT顯著提升，敲除突變體則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。結(jié)果表明GmMYB4是調(diào)控大豆類黃酮和原花青素生物合成及積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

圖3 GmMYB4調(diào)控大豆異黃酮含量及苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。

圖4 通過DAP-seq與RNA-seq在全基因組中對(duì)GmMYB4結(jié)合位點(diǎn)及靶基因進(jìn)行分析。

上述結(jié)果表明，GmMYB4是調(diào)控異黃酮含量的重要基因。為闡明GmMYB4調(diào)控異黃酮生物合成的分子機(jī)制，研究人員隨后克隆了異黃酮代謝途徑中10個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)基因（DEGs）的啟動(dòng)子，以探究GmMYB4是否能直接靶向這些基因。酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GmMYB4無法結(jié)合這10個(gè)基因的啟動(dòng)子。這提示GmMYB4可能通過其他調(diào)控因子，以間接調(diào)控的方式作用于異黃酮代謝途徑。

2. GmMYB4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GmTT8

MBW復(fù)合體由MYB、bHLH、WD40三類蛋白組成，此前在蒺藜苜蓿種發(fā)現(xiàn)其可抑制異黃酮合成酶（IFS）基因表達(dá)。研究人員通過酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了GmMYB115-GmTT8 復(fù)合體與10個(gè)關(guān)鍵基因（GmANS3、GmOMT5、Gm4CL、GmIFS2、GmANR2、GmF3H1、GmUGT、GmPAL1.3、GmC4H、GmCHS8）啟動(dòng)子的結(jié)合能力。結(jié)果表明，GmMYB115-GmTT8復(fù)合體可直接結(jié)合苯丙烷、異黃酮及花青素生物合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子，凸顯了其在這些代謝途徑中的調(diào)控作用。研究團(tuán)隊(duì)聚焦GmMYB4與MYB-bHLH-WD復(fù)合體（MBW）的互作機(jī)制，通過LCI、BiFC、Y2H、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示GmMYB4與大豆中bHLH類轉(zhuǎn)錄因子（GmTT8、GmGL3、GmEGL3）互作，競(jìng)爭(zhēng)性干擾GmMYB115–GmTT8復(fù)合體的形成，進(jìn)而解除MBW對(duì)異黃酮合成關(guān)鍵基因GmIFS2的抑制并減弱對(duì)花青素合成基因GmANS3的激活，實(shí)現(xiàn)異黃酮與花青素代謝流的平衡調(diào)控。

圖5 GmMYB4通過與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子互作，干擾MBW復(fù)合體的組裝。

核心發(fā)現(xiàn)三：GmMAPK6通過磷酸化GmMYB4，激活異黃酮合成通路

為解析GmMYB4的上游調(diào)控機(jī)制，作者進(jìn)行Co-IP、BiFC、Y2H、體外磷酸化實(shí)驗(yàn)及LC-MS/MS分析，結(jié)果表明GmMAPK6可與GmMYB4直接互作，并在體外磷酸化GmMYB4的第39位S39；過表達(dá)GmMAPK6顯著提升GmMYB4及其下游異黃酮合成基因的表達(dá)，促進(jìn)異黃酮積累。表明GmMAPK6通過“磷酸化修飾+轉(zhuǎn)錄激活"雙重機(jī)制調(diào)控異黃酮合成。

圖6 GmMAPK6可提高大豆異黃酮含量，上調(diào)GmMYB4基因及異黃酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，并能磷酸化GmMYB4蛋白。

小結(jié)

本研究系統(tǒng)揭示了GmMAPK6-GmMYB4-MBW模塊調(diào)控大豆異黃酮生物合成的分子機(jī)制：GmMAPK6通過磷酸化激活GmMYB4，GmMYB4進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MBW復(fù)合體中的bHLH成員，解除MBW對(duì)異黃酮合成基因的抑制并抑制花青素合成基因，最終實(shí)現(xiàn)異黃酮含量的精準(zhǔn)調(diào)控。為解析異黃酮代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新視角，并為大豆品質(zhì)改良與代謝工程育種提供了重要靶點(diǎn)與理論依據(jù)。

圖7 GmMAPK6-GmMYB4-MBW模塊在調(diào)控大豆異黃酮含量中作用的預(yù)測(cè)模型示意圖。