性別決定是高等植物發(fā)育的核心環(huán)節(jié)，對于黃瓜等葫蘆科作物而言，雌花的形成直接關(guān)乎果實與種子產(chǎn)量，更是保障糧食安全的關(guān)鍵所在。黃瓜的花原基初期本是雌雄同體，卻會在特定發(fā)育階段（如第5階段）通過雄蕊或雌蕊原基的選擇性停滯，最終分化為雄花或雌花。一直以來，乙烯與生長素都被證實能促進葫蘆科植物雌花形成，但二者調(diào)控性別決定的分子機制，以及它們之間如何協(xié)同作用，長期以來都是未解之謎。而作為生長素信號通路的核心因子，生長素響應(yīng)因子（ARFs）雖已被證實參與植物多種發(fā)育過程，卻從未有研究報道其與植物性別決定相關(guān)——這一關(guān)鍵空白，也讓葫蘆科植物的“性別密碼"更顯神秘。

2025年12月11日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張小蘭團隊在國際頂刊Science上發(fā)表了一篇題為“ARF3-mediated auxin signaling is essential for sex determination in cucumber"的研究論文，該研究借助DAP-seq精準鑒定出黃瓜生長素響應(yīng)因子CsARF3全基因組中的直接結(jié)合靶點，構(gòu)建了其調(diào)控性別決定的下游基因網(wǎng)絡(luò)，闡明了CsARF3的雙重調(diào)控模式，揭示了生長素與乙烯在性別決定中的協(xié)同作用機制，為植物性別決定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究帶來全新突破。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。

主要研究結(jié)果

（一）CsARF3是黃瓜雌花形成所必需的基因

本研究通過對兩性花黃瓜品系外源施加生長素，結(jié)果顯示雌花比例顯著提高，且16個黃瓜ARF基因中，僅CsARF3在雌性花芽中表達顯著高于雄性花芽，且在花性別決定前（6 期前）高表達。研究團隊構(gòu)建了Csarf3突變體和CsARF3過表達株系，發(fā)現(xiàn)CsARF3突變雌花轉(zhuǎn)變?yōu)樾刍?，即使外施生長素也不能回補Csarf3突變體的表型；CsARF3過表達株系的雌花產(chǎn)量增加8.0%，復(fù)合雌花（每節(jié)多朵雌花）比例提高5.7%。以上結(jié)果表明，CsARF3介導(dǎo)的生長素信號通路對黃瓜雌花形成至關(guān)重要。

圖1 . CsARF3促進黃瓜雌性化

（二）CsARF3通過調(diào)控下游靶基因調(diào)控雌花發(fā)育

1. CsARF3激活 CsSTM表達

KNOX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物莖尖分生組織（SAM）的形成與心皮發(fā)育進程，為探究CsARF3介導(dǎo)的雌性發(fā)育是否依賴KNOX轉(zhuǎn)錄因子，通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，Csarf3突變體異常心皮中多數(shù)黃瓜I類KNOX家族成員表達下調(diào)，其中CsSTM下調(diào)顯著，且CsSTM在雌花芽中高表達、在Csarf3突變體中低表達、在CsARF3過表達株系中高表達。研究團隊通過酵母單雜交、EMSA、ChIP-qPCR、DLR分析驗證，CsARF3可直接結(jié)合CsSTM啟動子的P2/P4生長素響應(yīng)元件（AuxRE）元件并激活其表達。接著，研究團隊構(gòu)建了CsSTM突變體，結(jié)果顯示弱突變體雌雄花比例降低、雌花出現(xiàn)延遲，強突變體無法形成莖尖分生組織，且Csarf3 Csstm雙突變體表型與CsSTM單突變體相似。以上結(jié)果表明，CsSTM既有保守維持莖尖分生組織功能，又作為CsARF3的下游基因促進黃瓜雌花形成。

圖2. CsARF3通過直接刺激黃瓜中CsSTM的表達促進雌性化

2. CsARF3抑制CsWIP1表達

CsWIP1通過抑制心皮發(fā)育調(diào)控葫蘆科性別決定。CsARF3和CsWIP1在雌雄花芽的心皮原基中表達模式相反，二者突變體表型也相反，研究團隊進一步對二者的關(guān)系進行研究。CsWIP1在Csarf3突變體中表達量為野生型的3倍，過表達CsARF3則使CsWIP1表達降低，同時在CsWIP1啟動子鑒定到5個AuxRE元件。體外和體內(nèi)實驗證實，CsARF3可直接結(jié)合P3元件；雙熒光素酶報告實驗證實，CsARF3可特異性抑制CsWIP1的轉(zhuǎn)錄活性。Cswip1 Csarf3雙突變體表現(xiàn)為雌全同株（可開雌花和兩性花）性狀，與僅開雄花的Csarf3突變體表型存在顯著差異，而與Cswip1突變體表型相近。以上結(jié)果表明，CsARF3在黃瓜中通過抑制CsWIP1的表達解除對心皮發(fā)育的抑制。

圖3. CsARF3在心皮發(fā)育過程中負向調(diào)控CsWIP1的表達

3. CsARF3的調(diào)控通路特征

通過DAP-seq分析，研究團隊進一步鑒定到CsARF3下游靶基因，包括心皮特征基因crabs claw（CRC）、agamous（AG）以及性別決定相關(guān)基因MYB62的黃瓜同源基因。轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果顯示，這些靶基因在Csarf3和Csstm突變體中均呈現(xiàn)共下調(diào)表達模式，而CsCUC2B的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化。此外，DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析結(jié)果顯示，Csarf3突變體與野生型的差異表達基因中，67%與CsARF3結(jié)合靶點重疊，這些共有基因顯著富集于“花分生組織決定性"和“花器官特征決定"等關(guān)鍵通路；同時，Csarf3與Csstm突變體有118個共有差異表達基因。以上結(jié)果表明，CsARF3-CsSTM通路在黃瓜單性花發(fā)育中起作用，且可能獨立于CsCUC2B。

圖4. CsARF3的DAP-seq分析

（三）CsARF3與乙烯通路的互作關(guān)系

ACS1G作為被報道的與黃瓜雌性表型相關(guān)的乙烯合成基因，于花發(fā)育極早期表達并引發(fā)乙烯爆發(fā)以誘導(dǎo)雌花形成。研究發(fā)現(xiàn)，外源施加乙烯類似物乙烯利不能誘導(dǎo)Csarf3突變體形成雌花，而對僅開雄花的乙烯合成突變體Csacs11和Csaco2施加生長素則可成功誘導(dǎo)雌花形成，說明乙烯通過生長素發(fā)揮促雌性化作用。研究團隊通過Csarf3突變體與攜帶ACS1G的雌性系的雜交實驗證實，CsARF3突變可顯著阻斷ACS1G介導(dǎo)的雌花發(fā)育過程。值得注意的是，此前在甜瓜中的研究已證實，生長素可促進CmACS7表達并抑制雄蕊發(fā)育。為進一步探究這一機制，研究團隊檢測了黃瓜中CmACS7的同源基因CsACS2的表達，結(jié)果顯示CsACS2在Csarf3和Csstm突變體中表達顯著下調(diào)，而在CsARF3過表達株系中表達上調(diào)。以上結(jié)果表明，生長素能夠正向調(diào)控乙烯的生物合成，二者在黃瓜性別決定過程中形成了相互作用的調(diào)控關(guān)系。

圖5. 黃瓜中CsARF3與已知性別決定基因的遺傳關(guān)系

研究總結(jié)

本研究提出了黃瓜性別決定的分子模型：CsARF3作為核心調(diào)控因子，通過直接激活CsSTM和抑制CsWIP1兩條通路促進心皮發(fā)育，同時與乙烯通路形成互惠調(diào)控，抑制雄蕊發(fā)育，最終決定雌花形成。揭示了生長素與乙烯在性別決定中的分子互作網(wǎng)絡(luò)，為葫蘆科作物的性別調(diào)控育種提供了理論依據(jù)和關(guān)鍵基因資源。